domingo, 17 de febrero de 2013

CUANTIFICACIÓN DE SAPONINAS EN RESIDUOS DE QUINUA REAL Chenopodium quinoa Willd.

REVISTA BOLIVIANA DE QUÍMICA                                                         VOLUMEN 29, No.2 – 2012
CUANTIFICACIÓN DE SAPONINAS EN RESIDUOS DE QUINUA REAL Chenopodium quinoa Willd.
Maribel Lozano a; Edga R. T icona a,,b, C risthian Carrasco b, Yonny F lores a; Giovanna R. Almanzaa*

aLaboratorio de Bioorgánica, Instituto de Investigaciones Químicas, UMSA, Campus Universitario de Cota Cota Edificio de la FCPN c. Andrés Bello y  c. 27 s/n, CP 303 La Paz, Bolivia,
bInstituto de Investigación de Desarrollo de Procesos Químicos, UMSA, Edificio de la Facultad de Ingeniería, Obelisco, La Paz, Bolivia.
 
Accepted: 21/10/12                                                                 Published: 09/12/12

Keywords:   Residues   of   quinoa,   Chenopodium quinoa Willd., quantification of  saponins, Foam method,   UV spectrophotometry method, HPLC method.

ABSTRACT
This work was performed to quantify the performance of extracts and saponins in residues generated by exporters of quinoa in the departments of La Paz, Oruro and Potosi, determining that the extraction yields range from 36.0 % to 39.4  %  w/w, while  the  percentage  of  saponins  in  the  extract  ranged  from  47.3  %  to  56.2  %  and  saponins  in  the residues from 17.3 % to 22.1 %. Additionally, a method was optimized for extraction of saponins by maceration with alcohol/water mixtures, considering the following parameters: mass/volume ratio of extraction, extraction time and percentage of EtOH/H2O (v/v), determining that the best m/v ratio is 1/9. The optimum extraction time is 72 h and the better extraction mixture is 50/50 EtOH/H2O. The percentage of saponins was determined using the methods of Foam, UV spectrophotometry and HPLC chromatography, showing that there are no major differences between the three methods, although the HPLC method is the best with less error and should be used as a control for the other methods which are cheaper. In addition, it is very important to use a standard of saponins from quinoa as reference sample in all the methods.

Corresponding author: giovyalmanza@yahoo.com.ar

RESUMEN
En el presente trabajo se realizó la cuantificación del rendimiento de extractos y de saponinas en residuos de escarificado generados en empresas  exportadoras  de  quinua  de  los  departamentos de  La  Paz, Oruro y Potosí, determinándose que los rendimientos de extracción varían desde 36,0 % hasta 39,4 % p/p, mientras que el porcentaje de saponinas en el extracto varía desde 47,3 % hasta 56,2 % y de saponinas en el mojuelo desde 17,3 % hasta 22,1 %. Adicionalmente, se optimizó un método de extracción de saponinas por maceración con mezclas hidroalcohólicas, considerando  los  siguientes  parámetros:  Relación  masa/volumen  de  extracción; tiempo de  extracción  y  relación porcentual EtOH/H2O (v/v), determinándose que la mejor relación m/v de extracción es 1/9. El tiempo de extracción optimo es de 72 h y la mejor mezcla de extracción es con 50/50 EtOH/H2O. El porcentaje de saponinas se determinó utilizando los métodos de Espuma, Espectrofotométrico UV y por cromatografía HPLC, observándose que no hay grandes  diferencias entre los 3  métodos  aunque el  método  HPLC es el que tiene  menos  error  y debería utilizarse como  método de control  para los otros  métodos que  son  más  baratos. Además, es  muy  importante  utilizar  como muestra de referencia un estándar de saponinas de quinua en todos los métodos.

INTRODUCCIÓN

Bolivia es el mayor productor y exportador de quinua real orgánica a nivel mundial con 46 % de la producción mundial. Esta variedad se produce únicamente en el Altiplano Sur de Bolivia donde la producción creció hasta en un 62,9 % en los últimos 7 años (INE 2009), este incremento se realizó principalmente los años 2005 y 2006 por su gran aceptación en mercados internacionales exóticos, de productos orgánicos y de comercio justo. Las exportaciones, principalmente a Estados Unidos, Francia, Países bajos y Alemania, se incrementaron desde 4 890 TM en el 2005 hasta 10 428 TM el 2008, constituyéndose en el principal  cultivo de la región occidental de nuestro país [1] y generando una serie de cambios económicos, ambientales, sociales y culturales en la región. La principal aplicación de la quinua es como alimento, principalmente por el alto valor proteico de sus granos [2]. Sin embargo, además de sus componentes nutricionales, la quinua tiene saponinas, unas sustancias de sabor amargo localizadas principalmente 
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en  el epispermo del grano, que deben ser eliminadas antes del consumo humano [3,4]. Para  su eliminación, las empresas  exportadoras  de  quinua, han desarrollado un proceso de beneficiado donde se separa el epispermo  del grano mediante dos procesos: El primero es basado en la fricción entre granos por acción mecánica (escarificado) obteniéndose un polvo rico en saponinas denominado “mojuelo”. El segundo es un proceso de lavado con agua para eliminar el epispermo restante. El rendimiento del “mojuelo” es de alrededor de 4,5 % respecto al grano [5], por lo que cada año se generan toneladas de estos residuos en el Occidente Boliviano. Las saponinas se constituyen en una familia de compuestos de gran interés para la Industria, particularmente las saponinas de la quinua han mostrado un efecto inhibitorio de hongos, como Botrytis cinérea [6],  toxicidad frente a camarones, actividad antiviral  y actividad molusquicida, contra el caracol que afecta cultivos de arroz Pomacea canaliculata [7], por lo que se ha propuesto su uso  en  agricultura  habiéndose  ya  registrado  un  biopesticida  en  base  a  saponinas  de  quinua  en  la  Agencia  de Protección Medioambiental de Estados Unidos (EPA, Environmental Protection Agency) con el nombre de Heads Up, destinado básicamente al control de hongos y enfermedades virales [8, 9]. Por otra parte, también tienen interés para la Industria Farmacéutica, por sus efectos reductores del colesterol, porque los fármacos co-administrados con saponinas mejoran la respuesta inmunológica del organismo debido a un aumento en su absorción [1, 10, 11] y por sus propiedades hemolíticas [12]. Finalmente, debido a sus propiedades surfactantes y emulsificantes, tiene interés en la elaboración de detergentes y como espumante en la elaboración de bebidas [13, 14]. Basados en el gran interés industrial  de las saponinas de quinua, el presente trabajo  presenta la cuantificación de saponinas en el “mojuelo”, generado  en  varias  empresas  beneficiadoras  de  quinua  de  los  departamentos  de  La  Paz,  Oruro  y  Potosí,  con  el objetivo de contribuir al posterior uso de estos residuos en base a su contenido de saponinas. Para esto, se hizo una optimización del método de extracción, para luego proceder a la cuantificación de saponinas utilizando tres métodos: Espuma, Espectroscopia UV-Vis y Cromatografía Líquida de Alta Resolución HPLC; de tal manera de comparar los resultados  y  además  determinar  el  mejor  método  de  cuantificación  de  este  importante  grupo  de  compuestos  de  la quinua real.

RESULTADOS Y DISCUSION
El  trabajo  se  inició  con  una  recolección  de  muestras  de  “mojuelo”  de  las  empresas  beneficiadoras  de  quinua  con mayor producción y mayor accesibilidad de los departamentos de La Paz, Oruro y Potosí. Durante esta recolección de muestras, además se realizó una encuesta enfocada a la producción y control de residuos generados en el proceso de beneficiado.
Tabla 1. Datos sobre la materia prima y residuos generados en empresas beneficiadoras de quinua

Fuente: Elaboración propia en base a encuesta

Empresa
Encuestado
Cargo
Materia
Prima
(Ton/año)
Residuos
Generados
(Ton/año)
% de Residuos Generados
1
Bio Andes
Oswaldo Diaz
Jefe de Producción
852
25,5
3,0
2
Jatary S.R.L.
Mario Miranda
Jefe de Planta
1500
42,9
2,9
3
QUIMBOLSUR
Edilverto Ignacio
Jefe de Planta
696
31,3
4,5
4
Real Andina
Javier Veliz Ramos
Jefe de Producción
516
27,8
5,4
5
CECAOT
Urbano Quispe Salinas
Presidente
732
36,5
5,0

6
Irupana Andean Organic
Food S.A.

Dennis Nava

Supervisor de Producción

580

21,9

3,8

7
Andean Valley S.A.
Ariel Vargas
Jefe de Producción
876
70,1
8,0

8
SAITE S.R.L
Eduardo Ramos
Administrador de productos orgánicos
1920
96,0
5,0
9
CITY S.R.L.
Lourdes Luque
Aux. Control de Calidad
1080
86,4
8,0
10
ANAPQUI
Ovidio Silva
Responsable de Producción
6132
306,6
5,0
11
Quinua Food
Jesús Pérez
Jefe Control de Calidad
540
24,0
4,4
12
COMRURAL
Edwin Kantuta Q.
Jefe de Operaciones
2040
122,4
6,0
                                              TOTALES                      17464      891,3

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La Tabla 1 presenta datos relevantes de la encuesta realizada. De acuerdo a estos datos se estima que se generan alrededor de 1000 Ton al año de residuos, esto considerando que no se encuestaron a todas las empresas beneficiadoras de quinua y que, de acuerdo a investigaciones realizadas por PROINPA y el PIEB,  se producen alrededor de 20 000 Ton de materia prima al año, las cuales en promedio generan alrededor de 4,5 % de residuos de escarificado. Como se puede observar en la Tabla 1, la empresa ANAPQUI es la principal generadora de este residuo, debido a que también es la que mayor cantidad de materia prima procesa. Luego están, las empresas SAITE, COMRURAL, CITY y Andean Valley generando junto a ANAPQUI alrededor del 70 % de residuos de escarificado. Por otra parte, se puede notar que el porcentaje de residuos generados varía entre un 3 a 8 % de la materia prima utilizada, este porcentaje depende sobre  todo de las condiciones y estado del escarificador, observándose que las empresas CITY y Andean Valley cuentan con un proceso de escarificado muy eficiente por el constante seguimiento y mantenimiento de sus equipos. Además de los datos mostrados en la Tabla 1, se preguntó sobre la procedencia de la materia prima, el control de calidad de ésta y sobre el uso o destino de los residuos de escarificado generados. Así se  determinó que en su mayoría adquieren la materia prima, quinua orgánica, de la zona intersalar. Entre los municipios productores tenemos: Santiago de Quillacas, Santiago de Huari, Salinas de Garci Mendoza, Pampa Aullagas, Uyuni, Llica, Tahua, San Pedro de Quemes, Colcha K, San Agustín y San Pablo de Lipes. En cuanto al control de calidad, en general solo cuentan con laboratorios básicos, aunque varios mencionaron  que el principal control se realiza en el lugar de destino, vale decir en Europa y Estados Unidos. Sobre el uso  de los residuos de escarificado, la mayor parte se desechan, una parte vuelve al lugar para utilizarlo como abono, otros pocos lo utilizan como pesticida junto a otras plantas y finalmente, existe una empresa que lo está vendiendo a Dinamarca (Andean Valley). Entre los residuos generados se puede observar diferentes coloraciones de acuerdo al color del ecotipo de quinua del que provienen, así por ejemplo tenemos: i)  Mojuelo Rojo, correspondiente a los ecotipos pisankalla y ayrampu; ii) Mojuelo Blanco, correspondiente al ecotipo blanca real; iii) Mojuelo Rosado o mezcla, denominado así por ser producto de una mezcla de  diferentes ecotipos y iv) Mojuelo Negro, correspondiente al ecotipo ajara. En general estos residuos se mezclan en las empresas beneficiadoras, lo cual no es aconsejable para el posterior uso de los mismos, ya que una diferente coloración también indica una diferente composición. Sin embargo, cabe mencionar que un 80 % de los residuos corresponden a quinua blanca. Finalmente, se pudo determinar que entre las empresas encuestadas se tienen un 21 % de empresas formadas por asociaciones de productores (como ANAPQUI, APQUISA, CECAOT), y el 79 % de empresas son privadas, aunque todas tienen estrecha relación con los productores para la adquisición de materia prima y es importante notar que los volúmenes de materia prima procesada por ANAPQUI son considerablemente mayores a las de las otras empresas, teniendo más del 30 % de la producción y exportación de quinua real.

Método de extracción de saponinas
Para la optimización del método de extracción se utilizó una muestra de mojuelo de quinua real blanca de la empresa Irupana Andean Organic Food, empleando como solventes mezclas de EtOH/H2O y como método de extracción la maceración a temperatura ambiente, de acuerdo a datos previos obtenidos en el Laboratorio [5]. Se evaluaron los siguientes factores: tiempo de maceración, relación porcentual H2O/EtOH y relación masa de mojuelo/volumen de solvente. Todos los factores fueron evaluados   inicialmente respecto al porcentaje de extracto obtenido, determinándose así como mejores valores: un  tiempo de maceración de 72  h  y  una  relación  de  masa  de mojuelo/volumen de solvente de 1/9, dado que a mayores valores no se observa una mayor extracción. Sin embargo, el  factor  más  influyente y que produjo mayores variaciones fue la composición H2O/EtOH de la mezcla de extracción. Es por esto, que en este caso, no solo se consideró el rendimiento del extracto sino también el porcentaje de saponinas presentes en los extractos. Así se realizó el análisis de saponinas por HPLC del estándar y de cuatro extractos obtenidos con mezclas de EtOH/H2O al 75, 50, 25 y 0 %  (Figura 1).  El análisis del perfil cromatográfico en HPLC del estándar muestra cuatro picos principales a tr de 15.4; 20.3; 21.2; 25.9 min que corresponderían a saponinas, los picos por debajo de 10 min no corresponden a saponinas. Comparando el perfil del estándar con el de los extractos podemos observar que el extracto de EtOH/H2O al 75% presenta  una gran cantidad de otros compuestos por debajo de 10 min y una menor proporción de las saponinas a 25,9 min; el extracto de EtOH/H2O al 50 % es el de mayor similitud al estándar. Finalmente, los cromatogramas c) y d) muestran perfiles muy similares entre sí, pero en comparación al estándar menor cantidad de saponinas, además  es  importante  mencionar  que  el mayor  porcentaje  de  agua  dificulta  más su secado y se observa la formación de una masa melosa probablemente correspondiente a azúcares libres. También se evaluaron las   saponinas por  los métodos de espuma y espectrofotometría UV/VIS, los resultados empleando las tres técnicas se muestran en la Tabla 2. Observándose que no hay  grandes diferencias entre los 3 métodos aunque el método HPLC es el que tiene menos error y debería
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utilizarse como método de control para los otros métodos que son más baratos y pueden emplearse en los laboratorios de control de las empresas beneficiadoras.

Figura 1. Cromatogramas RP- HPLC.
Figura 1. Cromatogramas RP- HPLC. a) estándar; b) extracto al 75 % EtOH/H2O; c) extracto al 50 % EtOH/H2O; d) extracto al 25 % EtOH/H2O; e) extracto al 100 % de H2O

Tabla 2. Análisis de saponinas en extractos obtenidos a diferentes concentraciones de EtOH/H2O
Solventes/Método
UV 528 nm
Espuma
HPLC
75 % EtOH/H2O
39,6 ± 1,6
37,9 ± 1,1
36,3 ± 0,1
50 % EtOH/H2O
58,5 ± 1,6
57,0 ± 1,0
56,7 ± 0,2
25 % EtOH/H2O
45,0 ± 1,3
44,7 ± 1,5
43,0 ± 0,2
H2O
38,4 ± 1,6
41,0 ± 1,7
36,9 ± 0,1
Por  tanto,  se  determinó  que  la  mejor  mezcla  de  solventes  es  EtOH/H2O  al  50  %  y  el  mejor  método  es  la cromatografía HPLC, aunque los otros métodos también se pueden utilizar, en particular el método de espuma, que resulta  mucho  más  barato,  pero  teniendo  en  cuenta  que  preferentemente  la  agitación  no  debe  ser  manual,  que los tubos deben tener una medida estándar y las lecturas de altura de espuma se deben realizar como mínimo tres veces por  cada  tubo,  registrando solamente  el  promedio  de  la  medida,  además  siempre  se  debe  tener  un  estándar  de saponinas de quinua como muestra de referencia, debido a que estándares de saponinas que no son de quinua generan mucho error.

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Análisis de saponinas en residuos industriales de beneficiado de quinua

Con el método de extracción determinado se obtuvieron extractos hidroalcohólicos de saponinas de las muestras de mojuelo  de  ocho  empresas  exportadoras  de  quinua  real:  Irupana  Andean  Organic  Food;  Saite;  Andean  Valley; APQUISA; Jatary; PROAMBOL; Real Andina y CECAOT. En los extractos obtenidos se evaluaron el rendimiento de extracción en % p/p y el contenido de saponinas en % p/p respecto al extracto y al mojuelo, utilizando el método de Espuma (Figura 2). Los rendimientos de extracción varían desde 36,0 % p/p en el caso de la empresa Real Andina hasta 39,4 % p/p en el caso de la empresa Irupana, mientras que el porcentaje de saponinas en el extracto varía desde 47,3 % hasta 56,2 % y de saponinas en el mojuelo desde 17,3 % hasta 22,1 %. Las empresas donde se observa mayor porcentaje de saponinas en sus extractos son: Irupana, Saite y Andean Valley, que tienen las mejores condiciones de almacenamiento de residuos, ya que poseen depósitos de almacenamiento de  mojuelo. La letra B indica que el mojuelo es de quinua blanca, R de quinua roja y M  de mezcla de residuos, determinándose que el ecotipo de Quinua Real Blanca es el que tiene mayor concentración de saponinas, esto debido a que en los otros ecotipos aumenta el porcentaje de colorantes.

Figura 2. Evaluación de % Extractivos, % de saponina en el extracto y % de saponina en el mojuelo por el método de espuma
Figura 2. Evaluación de % Extractivos, % de saponina en el extracto y % de saponina en el mojuelo por el método de espuma, de residuos obtenidos en diferentes empresas beneficiadoras de Bolivia.

Por tanto, se determinó que el contenido de saponinas en el mojuelo de las empresas beneficiadoras de quinua está alrededor del 20 %, lo cual resulta muy interesante considerando que las saponinas tienen diversas aplicaciones en la industria de pesticidas orgánicos [6-9], en la industria farmacéutica [10-12] y en las industrias de detergentes y de bebidas espumantes [13,14]


SECCION EXPERIMENTAL

Equipos y Reactivos

Las  mediciones  por  el  método  espectrofotométrico  se  realizaron  en  un  Espectrofotómetro  UV-Vis  Aquarius  7000 series, el método de cromatografía líquida de alta resolución se desarrolló en un equipo HPLC Agilent 1100 series, con detector DAD y utilizando una columna RP C18. Los solventes utilizados para la extracción (EtOH y H2O) tenían grado q.p. pero fueron purificados por destilación  previamente a su uso, el solvente utilizado para el análisis espectrofotométrico (MeOH) tenía grado p.a. y los solventes utilizados para el análisis cromatográfico (ACN y H2O) calidad HPLC.

Materia prima

Las muestras de mojuelo, o residuos de escarificado, se recolectaron entre agosto de 2008 y mayo de 2009  de empresas beneficiadoras localizadas en los departamentos de La Paz, Oruro y Potosí (Tabla 1), las cuales procesan

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quinua proveniente principalmente de la zona intersalar del Altiplano Sur de Bolivia. Durante la recolección  de muestras se hizo también la recolección de información a través de encuestas, sin embargo no en todas las empresas visitadas y encuestadas nos facilitaron los residuos de escarificado en la cantidad suficiente para realizar el presente trabajo, esto debido a la inexistencia de estos residuos en el momento de la encuesta o porque no estaba la persona responsable de la dotación, por este motivo el número de residuos analizados no se corresponde con el número de empresas encuestadas. En total se seleccionaron 10 muestras de mojuelo, las cuales fueron clasificadas de acuerdo al color que presentaban en: Blanca (B), Roja (R) y Mezcla (M), para luego ser nombradas de acuerdo a la empresa de la que provenían y el color que presentaban, así por ejemplo Saite-R corresponde a una muestra de la empresa Saite y la letra R indica su color rojo (ecotipo pisankalla o ayrampo).

Optimización del método de extracción

Para optimizar el método de extracción de saponinas del mojuelo de quinua real, se trabajó con una  muestra  de residuos de quinua real blanca de la empresa Irupana Andean Organic Food S.R.L., debido a que en ésta empresa se nos brindó facilidades para el control y acceso a estos residuos, además de que se encuentra localizada en la ciudad de La Paz. Para la extracción se eligió la técnica de maceración a temperatura ambiente debido a que las saponinas son termolábiles, pudiendo  sufrir  hidrólisis sobre los 70ºC. Por  otra parte se eligieron como  solventes mezclas de etanol y agua, debido a datos previos del grupo [5] además que se pretende que este método sirva para posteriores aplicaciones industriales y estos solventes son económicos y de gran disponibilidad en Bolivia. En base a estos datos, para la optimización se evaluaron los siguientes factores: tiempo  de maceración, relación porcentual H2O/EtOH y relación masa de mojuelo/volumen de solvente, para cada factor se  tomaron en cuenta cuatro niveles correspondientes a cada experimento como E-1, E-2, E-3, E-4; como se describen en la siguiente tabla 3.
Tabla 3.Factores  de evaluación para la optimación del método de extracción de Saponinas
PARAMETRO
E-1
E-2
E-3
E-4
Tiempo de extracción (h)
24
48
72
96
Mezcla  agua/etanol (%)
100
75
50
25
Relación masa/volumen [mg/mℓ]
1;1
1;2
1;3
1;4

En cada experimento se evaluó como variable respuesta el rendimiento de la extracción. La variable más importante es  la  mezcla  de  solventes  empleada  donde  además  se  determinó  el  %  de  saponina  en  el  extracto  mediante  los métodos: espectrofotometría UV-Vis,   cromatografía liquida de alta resolución  HPLC, y altura de espuma. En cada caso, el extracto obtenido fue concentrado a presión reducida hasta la evaporación total del etanol, el residuo acuoso luego fue congelado a -18ºC durante 24 h y a -80ºC durante 3 h para ser llevado a liofilización por un periodo de 72 h, luego del cual el extracto seco se pesó para los cálculos posteriores de rendimiento de la extracción.

Determinación del contenido de saponina por el método de espuma
Para esta prueba se siguió el método establecido por Koziol [14] que en primera instancia requiere la elaboración de una curva de calibración con un estándar. El estándar de saponinas de quinua real fue obtenido en la Universidad de Santiago de Chile y tiene en su composición 80 % de saponinas. Con este estándar se prepararon cinco soluciones en concentración creciente que fueron procesadas de la siguiente manera: Se disponen 5 ml de agua destilada en tubos de ensayo de 18 mm de diámetro, por triplicado. Se introducen en los tubos 0,8; 1,6; 2,4; 3,2 y 4 mg del estándar y se tapa cada tubo con parafilm. Se dispone cada tubo en posición vertical y se agita vigorosamente 30 s, luego de los cuales se coloca el tubo en una superficie horizontal y se retira el parafilm. La primera medición (altura de espuma en cm) se toma luego de transcurridos 30 segundos después de la agitación. La segunda medición (altura de espuma en cm) se toma luego de transcurridos 15 minutos de la agitación. Después de la segunda medición, se agita nuevamente cada tubo por 30 segundos y se registra nuevamente la altura de espuma a los 30 s después de la agitación y luego de 15 min de reposo. Con esta metodología se realizó la curva de calibración obteniéndose una recta que corresponde a la  ecuación: Y  =  2,154X  +  0,455  con  R2=  0,988.  En  base  a  la  ecuación  de  la  recta  de  calibración  se  calculó  el porcentaje de saponinas de cada muestra utilizando las siguientes ecuaciones:
Y = 2,154X + 0,455
Z = X/W * 100
Dónde: X = mg de saponina en 5mℓ de solución acuosa; Y = Altura de espuma en cm; Z = Porcentaje de saponina en el extracto y W = mg de extracto en 5 mℓ de solución acuosa.
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Determinación del contenido de saponina por espectrofotometría UV-VIS
Para esta determinación se siguió el protocolo   establecido por Monje y Raffaillac [15]  en el cual se hace uso de la adición del reactivo de Lieberman-Burchard (LB) para formar productos coloridos al reaccionar con saponinas. El reactivo LB consiste en una mezcla al 16,7 % de Anhídrido acético en Ácido sulfúrico concentrado. Al igual que en el anterior caso, inicialmente se elaboró una curva de calibración Absorbancia vs. Concentración  utilizando  el estándar obtenido en Chile. Para esta curva se prepararon soluciones a las siguientes concentraciones: 0,00; 0,05; 0,1; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30; 0,35 mg/mℓ, de cada concentración se prepararon 2 mℓ, a los cuales se adicionaron 7 mℓ del reactivo de LB, se agito 20 s con un vortex y se dejó en reposo 30 min. Finalmente para determinar la longitud de onda de la máxima absorción (λmax)  para  realizar  las lecturas posteriores en el espectrofotómetro,  se  realizó  un barrido con el estándar. La λmax  determinada fue de 528 nm y a esta longitud de onda se realizaron las mediciones para la curva de calibración y posteriormente para las muestras de mojuelo seleccionadas. La curva de calibración dio una recta de ecuación Y = 0,912X – 0,003 y R2= 0,995. De manera similar al anterior método, a partir de la curva de calibración se pudo cuantificar el porcentaje de saponinas presentes en cada muestra evaluada.

Determinación de saponinas por cromatografía liquida de alta resolución HPLC
Para  el  análisis  de  saponinas  por  HPLC  se  acondicionó  un  método  en  base  a  los  métodos  desarrollados  por  San Martín  &  Briones  [16]  y  Madl  et  al  [17].  El  análisis  fue  realizado  en  un  equipo  HPLC  Agilent  1100  series.  Las separaciones fueron corridas en una columna Kromasil RP C18    de 4 mm*125 mm d.i., 5µ m a 20oC y 210 nm. Se inyectaron 5µ ℓ de muestras de concentración 30 mg/mℓ de extracto de mojuelo. Para la separación se empleó como fase móvil agua al 0,1 % en acido fórmico como solvente “A” y Acetonitrilo como solvente “D”, para la elución se trabajó con un sistema en gradiente lineal de 75 % a 65 % de solvente “A” con un flujo constante de 0,7 mℓ/min durante 15 min, luego se cambió de flujo de 0,7 a 1,0 mℓ/min en los siguientes 20 min con un gradiente lineal de 65 % a 55 % de solvente “A”. Las muestras, previamente a la inyección al equipo, fueron preparadas por disolución de 30  mg/mℓ de  extracto  en  agua  grado  HPLC  con agitación magnética de 3  min en vasos de precipitado de 10 mℓ cerrados con parafilm, luego se pasaron por un filtro de mezcla éster celulosa (Mixed cellulose Ester DISMIC-25)  de 0,45  µ m y se  repartieron en ependorfs de 1mℓ  previamente  autoclavados a 121oC.  Para  la  cuantificación  de saponinas por este método se realizó inicialmente el cromatograma del estándar, luego con el mismo método y por duplicado de cada una de  las  muestras, los resultados  se  dan  en  porcentaje  relativo de la  composición total de saponinas en el extracto,  mediante una comparación  de  áreas totales de la  muestra respecto  con  el  estándar de saponinas considerando que este tiene una pureza del 80 %. Es así que se empleó las ecuaciones que se muestran a continuación:

X= A/B * 80 ; Y= X*R/100

Dónde: X = porcentaje de saponina en el extracto; A = área total de la muestra; B = área total del estándar; Y = porcentaje de saponina en el mojuelo y R = rendimiento de extracción

AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Agencia Sueca ASDI por el financiamiento a los proyectos “Estudio de la Biodiversidad Vegetal” y “Pesticidas Orgánicos a partir de Especies Vegetales Andinas de Bolivia (Parte I)” gracias a los cuales se pudieron realizar las investigaciones del presente trabajo. Así mismo, quieren agradecen al personal de las empresas beneficiadoras visitadas,  por  toda  su  colaboración, en  particular al de la empresa Irupana Andean Organic Food S.R.L. que permitió la observación y control de las muestras de residuos de escarificación colectadas.

REFERENCIAS
1. Quintanilla R. J. Capítulo I Producción de Quinua: Oruro Potosí. La Paz, Bolivia, 2010, pp 32-63
2. IBCE (Instituto Boliviano de Comercio Exterior) La Quinua: Oportunidades para su comercialización a nivel mundial, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia, Junio 2010. Nº 183
3. Maestebroek H., Limburg H., Gilles T., Marvin H. Ocurrence of sapogenines in leaves and sedes of quinoa (Chenopodium quinoa Willd). Journal of the Science of food and Agriculture 2000, 80, pp 152-156
4. Centro de Promociones de Tecnologías Sostenibles (CPTS). Estudio de caso PML, Empresa Andean Valley S.A. 2006, AVSA 01
5. Flores  Y.,  Díaz  C.,Garay F.,Colque  O.,Sterner  O.,  Almanza  G.  R.  “Oleanane-type  triterpenes  and  derivatives  from  seed  coat  of  Bolivian Chenopodium quinoa genotype salar” Revista Boliviana de Química2005, 22, Nº1, pp 71-77
6. Kuljanabhagavad,  T.  and  Wink,  M.  “Biological  activities  and  chemistry  of  saponins  from  Chenopodium  quinoa  Willd”.  Phytochemistry Review 2009, 8, pp 473-490                                                                           
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7.  San  Martin  R.,  Ndjoko  K.,  Hostettmann  K.  “Novel  molluscicide  against  Pomacea  caniculata  based  on  quinoa  (Chenopodium  quinoa) saponins”, Crop Protection2008, 27, pp 310-317
8.  ES 1940232 (Patente Europea) Method and a composition of a biopesticida based on quinoa saponins (Chenopodium quinoa). 2005
9.  Estrada  A.,  Redmond  M.  J.;  LaarveldB.,  US005688772A  (Patente  nortemaericana)  Quinoa  saponin  compositions  and  methods  of  use Saskatoon, Canada, 1997
10.Cui M., Song F., Zhou Y., Liu Z. and Liu S. “Rapid identification of saponins in plant extracts by electrospray ionization multi-stage tándem mass spectrometry and liquid chromatography/ tandem mass spectrometry”. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000, 14, pp. 1280–1286.
11. Vega  A.,  Miranda  M.,  Vergara  J.,  Uribe E.,  Puente L. y Martinez E. “Nutritional facts and functional potential of quinoa (Chenopodium quinoa Willd), an ancient grain: a review”. Journal of the Science of Food and Agriculture2010, 90, pp. 2541–2547.
12. Reichert  R.  D.,  Tatarynovich  J.  T.,  Tyler  R.T.  “Abrasive  Dehulling  of  Quinoa  (Chenopodium  quinoa):  Effect  on  Saponin  Content  as Determined by an Adapted Hemolytic Assay”. Cereal Chemistry 1986. 63 Nº 6, pp 471-475
13. Güclü-Üstundaga  O.  & Mazzaa  G.  “Saponins: Properties,  Applications and  Processing”,  Critical  Reviews in Food Science and Nutrition 2007, 47, Nº 3, pp. 231-258
14. Koziol M.J. “Afrosimetric estimation of threshold saponin concentration for bitterness in quinoa (Chenopodium quinoa Willd)” Journal of the Science of Food and Agriculture 1991, 54 Nº2 pp. 211–219
15.Monje  C.  Y.,  Raffaillac  J.  P.  “Determinación  de  saponina  total  en  quinua  (Chenopodium  quinoa Willd)  método  Espectrofotométrico”. Memoria  IV  Congreso  Nacional  de  la  Asociación  Boliviana  de Protección  Vegetal.  Oruro,  5  al  7  de  abril  de  2006.  C.E.A.C.  –Dpto. Fitotecnia-FCAPV UTO. ABPV. Oruro, Bolivia, pp. 217-218
16.San Martín R., Briones R. “Quality control of commercial quillaja (Quillaja saponaria Molina) extracts by reverse phase HPLC”, Journal of the Science of Food and Agriculture 2000, 80, pp. 2063- 2068.
17.Madl T., Sterk H., Mittelbach M. “Tandem Mass Spectrometric Analysis of a Complex Triterpene Saponin Mixture o Chenopodium quinoa”, J. Agric. Food Chem 2006, 17, pp. 795–806.

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Lozano P. Maribel, et al. - Cuantificación de saponinas en residuos de Quinua Real by Rubén Miranda

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